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同源重组构建质粒原理详解

发布者:新宝gg—创造奇迹登录    发布时间:2021-11-09     
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分子生物学研究中质粒构建是最常用的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶,DNA 连接酶和其他修饰酶的作用,分别对目的基因和载体 DNA 进行适当切割和修饰后,将二者连接在一起,再导入宿主细胞,实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

同源重组的基因克隆方法, 相比双酶切载体构建方法,该方法的构建过程有些不同,双酶切构建过程比较繁琐,同源重组构建过程相对简单,可以省去很多的时间和精力,但假阳性率略高。


同源重组法构建载体

首先,靶基因片段扩增引物有别于常规引物设计;

其次,载体切割过程中只需要进行单酶切;

第三,载体和目的基因片段的连接是基于同源重组而不是粘性末端互补。

 

采用同源重组法构建载体与常规双酶切构建载体方法不同。

首先,设计引物时上游引物5’端前面加的是酶切位点(如Hind III)及该酶切位点在pMIR reporter载体中对应前面的15个碱基载体片段,下游引物5’端前面加的是Hind III酶切位点及该酶切位点在pMIR reporter载体中对应后面的15个碱基载体片段,如此设计引物是为了保证目的片段插入载体时方向正确。

其次,载体只需要单酶切,用Hind III酶切pMIR reporter,使得pMIR reporter成为两端都带着Hind III位点的线性载体。相比双酶切切割载体,单酶切可以保证酶切后的载体都是单一的线性片段,使得后续的重组连接更准确。

第三,省去了TA克隆环节。因为PCR产物可以直接用于重组连接,不需要酶切产生粘性末端,而且重组酶的重组能力强于T4 DNA连接酶的连接能力,一般只需要一步即可重组连接成功,因此可以在重组反应之后进行测序鉴定。


详解:

基于同源基因重组原理,适用于向几乎任何载体在任何位点进行定向克隆,无需考虑插入片段自身携带的酶切位点可高效克隆 50 bp~10 kb 片段,同时构建时间也大大缩短。


1. 载体的制备一般推荐双酶切线性化,线性化完全,假阳性克隆低。酶切体系同上。


2. 对于使用重组方式连接来说,PCR 要设计引物, 设计引物时要根据质粒载体和基因序列选择合适的同源序列,通过 PCR 扩增方式进行连接,PCR 的产物要纯化。


引物设计原则简单总结一下:

(1)前向引物:5’ 端--上游克隆载体末端同源序列+基因正向扩增引物--3’ 端

(2)反向引物:3’ 端--基因反向扩增引物+下游克隆载体末端同源序列--5’ 端


如果设计的基因特异插入片段扩增产物长度较长,可以选择 PCR 方式进行目的引物的扩增。


[可选 PCR 扩增体系]

ddH2O                       14 ul

10 x Taq buffer           2 ul

10 um DNTP              1 ul

10 um primer F          0.5 ul

10 um primer R          0.5 ul

Vector                        1 ul

Taq 酶                        1 ul


[可选 PCR 扩增条件]

(1)95℃:5min

(2) 35cycle

95℃:30s

55℃:30s(退火温度可以根据目的引物TM值决定,一般退火温度根 据引物TM值降低5度)

72℃:40s

(3)72℃:10min

(4)16℃:hold

PCR 扩增后,通过胶回收方式获得纯化的 PCR 产物。纯化后的 PCR 产物不需要进行酶切,直接用于重组反应。


3. 目的引物与线性载体进行重组反应。


[可选重组体系]

5 × CE II Buffer           4 μl

线性化克隆载体          50~200 ng

插入片段扩增产物      20~200 ng

ExnaseII                  2 μl

ddH2O                        x ul


在冰水浴中配制,配制完成后,用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分,置于 37 ℃ 反应 30 min。待反应完成后,立即将反应管置于冰水浴中冷却 5 min。重组效率在反应 30 min 左右达到最高,反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率,这样大大减少了连接时间。


4. 转化

将连接产物转化到受体菌中(一般为 DH5a),涂板,培养过夜。


5. 挑取单克隆,并鉴定

挑去平板上的单克隆培养,可以通过 PCR 或者酶切初步鉴定阳性克隆,对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。


最后,几个主要注意事项:

1. 载体克隆位点选择尽量选择无重复序列,且 GC 含量比较均匀的区域进行克隆。当克隆位点上下游 20 bp 区域内 GC 含量均在 40%~60% 范围之内时, 克隆效率将达到最大.

2. 最适克隆载体与插入片段摩尔比为 1:2,即最适插入片段使用量为 0.06 pmol。这些摩尔数对应的 DNA 质量可由以下公式粗略计算获得:

最适克隆载体使用量 = [0.02 × 克隆载体碱基对数] ng(0.03 pmol)

最适插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段碱基对数] ng(0.06 pmol)

3. 双酶切 1 和 2,在设置酶切体系时要考虑酶切温度以及 Activity in NEBbuffer 的问题。


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